D-熒光素是一種多功能的生物發光底物。螢火蟲熒光素酶/熒光素生物發光系統存在于螢火蟲（Photinus pyralis）和其他幾種甲蟲中。熒光素酶通過二氧雜環丁酮中間體氧化ATP活化的熒光素。螢火蟲熒光素酶通過熒光素的ATP依賴性氧化產生光。來自該反應的560nm化學發光在數秒內達到峰值，當熒光素和ATP過量存在時，光輸出與熒光素酶活性成比例。螢火蟲熒光素酶長期以來與抗體結合，并在熒光素作為檢測底物的免疫測定中用作標記物。與HRP和堿性磷酸酶相比，熒光素酶對化學修飾的耐受性較差。該酶的一個特別優點是除了其高靈敏度之外，在哺乳動物組織中存在低內源熒光素酶活性。熒光素酶的另一個重要用途是衛生監測領域。熒光素酶/熒光素系統可用于檢測污染，因為存在于所有生物體中的ATP需要產生發光。這種ATP生物發光的主要應用是通過測試食品加工廠中的表面來確定質量，以確定是否存在設備或產品的污染。